**培养条件**：本实验采用的培养条件为气相组成95%空气和5%二氧化碳，温度设定在37℃。对于细胞传代，建议初次传代的比例为1:2。关于传代的具体情况，需每两天更换培养液。

如需购买细胞，建议一并选择**南宫28NG相信品牌力量**的完美培养方案，享受超值优惠。在收到细胞后，务必处理至良好状态，充分灌满完全培养液，并封好瓶口，以确保最佳运输效果。

收到细胞后，应使用75%酒精喷洒整个细胞瓶进行消毒，然后将其放入超净台中进行严格的无菌操作。接着将细胞瓶放置在37℃、5% CO2的培养箱中静置3-4小时，以便稳定细胞状态，之后即可进行后续处理。使用显微镜观察细胞的生长情况并拍照保存不同倍数的细胞图像（建议40x、100x、200x各一张），前三天的照片是重要的售后依据，如果未提供照片则默认收到状态良好。

**细胞培养步骤**:

a. **细胞传代**：当细胞未超过80%汇合度时，将培养瓶内的完全培养液收集至离心管，保留5ml培养基后放入37℃、5% CO2孵箱中培养；一旦细胞密度超过80%，可进行传代。对于贴壁细胞的传代步骤如下： 1. 弃去培养上清，使用不含钙、镁离子的PBS洗涤细胞1-2次。 2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1-2ml至培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，观察细胞状态；若细胞大部分变圆并脱落，迅速取回操作台，轻轻敲击培养瓶后加至少5ml完全培养基以终止消化。 3. 轻轻吹打细胞，确保其完全脱落，再吸出液体，将悬液转移至15ml离心管中，1000rpm离心5分钟，弃去上清，补加1-2ml完全培养基并重悬。 4. 将细胞悬液按1:2比例分瓶（即分至两个T25瓶），补充新的完全培养基至每瓶5-8ml，最后放入37℃、5% CO2培养箱中继续培养。

悬浮细胞传代步骤： 1. 使用半换液法，竖着放置培养瓶在培养箱静置1小时，轻轻吸掉约3ml培养基，再补充3ml的完全培养基；如果培养基变色较慢，可以直接添加约500ul FBS。在传代时亦可直接增加5ml培养基并分至两个培养瓶，经过3次这样的传代后可进行一次离心传代，以去除死细胞。 2. 采用离心换液法，若需分瓶可将细胞悬液收集至离心管中，1000rpm离心5分钟，弃去上清，补后加入1-2ml培养液重悬，然后将细胞悬液按1:2比例分到新T25瓶中，添加6-8ml新的完全培养基以支持细胞生长，后续传代可根据实际情况按1:2至1:5的比例继续进行。

b. **细胞冻存**： 1. 当细胞生长至覆盖培养瓶80%面积时，弃去T25培养瓶中的培养液，使用PBS清洗细胞一次。 2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml至培养瓶中，倒置并在显微镜下观察，待细胞回缩变圆后加入5ml完全培养液终止消化，再轻轻吹打细胞使之脱落，将悬液转移至15ml离心管中，1000rpm离心5分钟。 3. 弃去上清，沉淀细胞后加入1ml的无血清冻存液（货号：C7001），混匀后装入冻存管中。 4. 将冻存细胞直接放入-80℃冰箱保存，如需转入液氮罐，则需在-80℃冰箱存放24小时以上再转入液氮罐中。

c. **细胞复苏**： 1. 从液氮中取出细胞冻存管（需佩戴防护面具），迅速置入37℃水浴中解冻，直至无结晶后，用75%的酒精擦拭冻存管外壁； 2. 将冻存管中的细胞移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000rpm离心5分钟； 3. 弃去上清，沉淀细胞后用5ml完全培养基重悬并接种至T25培养瓶，放入37℃，5% CO2培养箱中培养； 4. 第二天换用新鲜完全培养基继续培养。

**注意事项**：部分细胞在运输过程中可能会脱落，这是正常现象。如脱落的细胞数量较多，可将瓶中的培养液收集至离心管，1000rpm离心5分钟，收集上清进行过渡培养。在此过程后续可根据需要加入胰酶1-2ml，轻轻吹打使细胞脱落，1-2分钟后再加入5ml完全培养基终止反应。再次离心后弃去上清，重悬后按1:2的比例进行分瓶传代（两个T25瓶），并在每瓶中补充新培养基至5-8ml，最后放入37℃，5% CO2培养箱中进行培养。