在生物医学领域，YF®488、YF®555、YF®594和YF®647的主要区别在于它们所带的荧光基团不同，因此在检测EDU时发射出来的荧光颜色也各不相同。尽管实验效果相似，研究人员可以根据自己的需求和喜好进行选择。对于EdU试剂盒中的3% BSA在PBS中的作用，它可以在清洗步骤中终止未反应的甲醛，从而提高染色的准确性。

人们常常会问，是否能够在活细胞中进行Click-iT EdU检测？答案是否定的。虽然EdU能够为活细胞提供代谢标记，但叠氮化物检测试剂与其缓冲液成分不是细胞透过型的，Click反应必须在固定和通透的样品上进行。

质粒转染后表达的荧光蛋白与Click反应的兼容性也是许多研究者关注的焦点。需要说明的是，该产品会影响GFP、RFP和mCherry等荧光蛋白的信号，因此建议使用GFP抗体进行间接检测，以获得更准确的结果。

如果观察到较高的背景干扰，这可能是由于洗涤不充分造成的。为减少背景干扰，最佳的方法是增加BSA的洗涤次数。同时，可以设置无染料或无Click反应的对照组，从而排除自发荧光的影响。此外，可以在无EDU的体系中进行完整的Click反应，以验证信号的特异性。

对于标记样品无信号或特异性信号非常低的情况，可以考虑以下几点来提高信号：1. 确保所用试剂无色，避免使用变黄的添加剂或缓冲液；2. 为了确保Click反应试剂能够有效进入细胞核，细胞必须充分固定和通透；3. 避免在任何缓冲液或试剂中引入金属螯合剂（如EDTA、EGTA或柠檬酸盐等），这可能会干扰反应；4. Click反应需要在适合的铜离子化合价下进行，一价铜（Cu+）是有效的；5. 延长Click反应时间超过30分钟不会提高信号，建议使用新鲜的Click反应试剂，再次孵育30分钟以提高标记效率。

在对细胞核进行复染时，EdU试剂盒中配备的Hoechst 33342可以在Click反应后用于染色。此外，也可以选择使用DAPI。这种方法同样适用于检测植物细胞核内的DNA复制，因为EdU作为小分子能够穿透植物细胞的细胞壁。

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